Федеральный научно-методический Центр по профилактике и борьбе со СПИДом
Перейти на главную страницу сайта
Последние эпидемиологические данные по ВИЧ-инфекции в Российской Федерации
(по состоянию на 31.12.2014 г.)
Кумулятивное количество зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции среди граждан Российской Федерации (с 1987 г. по 31.12.2014 г.):907607
Количество людей, живущих с диагнозом ВИЧ/СПИД в Российской Федерации на 100 000 населения (пораженность):494,6
Количество новых случаев ВИЧ-инфекции среди граждан Российской Федерации в 2014 г. :85252
Основные причины заражения ВИЧ среди впервые выявленных в 2014 г. ВИЧ-позитивных с установленными факторами риска заражения:
— употребление наркотиков нестерильным инструментарием:57,3%
— гетеросексуальные контакты:40,3%
© Федеральный научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом
Подробная статистика
Тел. +7 (495) 366-05-18, 365-30-09

ИНФОРМАЦИЯ

Уважаемые посетители!
Федеральный научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом проводит набор пациентов для участия в клинических исследованиях.



По всем вопросам обращаться в ФНМЦ ПБ СПИД: тел.8(495)3653009, Деулина Марина Олеговна, Попова Анна Анатольевна.

Оптимизация метода выделения провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека 1 из цельной крови

Сборник тезисов 5-й Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных болезней. — Москва, 2004, С. 169-173.

Башкирова Л. Ю., Богословская Е. В., Шипулин Г. А.


Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии МЗ РФ, г. Москва.


Введение

Для диагностики ВИЧ-инфекции используется иммуноферментный анализ (обнаружение в крови антител к ВИЧ) с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга. Однако, метод ИФА не эффективен для диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Это связано с тем, что в крови у таких детей материнские антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение длительного времени, даже если ребенок не инфицирован ВИЧ. На сегодняшний день наиболее эффективным методом для ранней диагностики ВИЧ-инфекции у детей, является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет выявлять нуклеиновые кислоты вируса с высокой чувствительностью и специфичностью.

Для ПЦР-диагностики ВИЧ-инфекции в России используется две тест-системы: «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96», разработанная в Центральном НИИ Эпидемиологии МЗ РФ и «Amplicor HIV 1 test» фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария). Методики, положенные в основу этих тест-систем, аналогичны: тест-системы позволяют обнаружить ДНК провируса ВИЧ, интегрированного в геном мононуклеарных клеток периферической крови.

Одним из недостатков этих тест-систем является нестандартизованный метод выделения ДНК из клеток крови, требующий определенных навыков работы. При недостаточном уровне подготовки персонала данный метод может привести к значительному снижению чувствительности анализа и большому количеству ложноотрицательных результатов. В связи с этим целью настоящей работы была разработка и апробация полуавтоматического метода выделения провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека из цельной крови.

Материалы и методы

В работе исследовали цельную кровь, полученную от 205 ВИЧ-инфицированных пациентов. Кровь забирали из локтевой вены утром натощак в пробирки с 1/10 объема 3% ЭДТА. Цельную кровь хранили при температуре 2-80°С не более 3 дней.

Анализ крови на наличие ДНК ВИЧ осуществляли с помощью ПЦР тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96». Методика ПЦР-анализа состояла из четырех этапов: получение лейкоцитов из цельной крови, лизис клеток с высвобождением ДНК, амплификация ДНК, детекция продуктов амплификации.

Получение лейкоцитов из цельной крови

Лейкоциты крови получали двумя способами:

1. С помощью методики, используемой в тест-системе «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96».

2. С помощью разработанной нами полуавтоматической методики.

Методика выделение лейкоцитов из цельной крови, используемая в тест-системе «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96».

Методика заключается в селективном лизисе эритроцитов крови с помощью раствора «Гемолитик». Для анализа использовали 250 мкл цельной крови. В результате 3-кратной обработки крови раствором «Гемолитик» получали осадок лейкоцитов.

Полуавтоматическая методика выделения лейкоцитов из цельной крови.

В основу разработанной нами методики был положен принцип иммуной сорбции клеток крови, содержащих CD4 рецепторы (т. е. тех клеток, которые инфицирует и в геном которых интегрирует вирус иммунодефицита человека). В качестве «сорбента» использовали парамагнитные частицы, покрытые моноклональными антителами, специфичные к CD4-рецепторам («Dynal», Норвегия). Выделение CD4-клеток, связавшихся с магнитными частицами, проводили с помощью полуавтоматического экстрактора «KingFisher» («Thermo Labsystems», Финляндия).

Для выделения клеток использовали 1 мл цельной крови, в которую добавляли 30 мкл магнитных частиц. После инкубации и отмывки иммунокомплекса, состоящего из магнитных частиц и СD4 лимфоцитов, получали чистую фракцию CD4-лимфоцитов.

Лизис клеток

Клетки крови, полученные двумя способами, лизировали с помощью раствора «Цитолизин» при температуре 600°С 30 минут.

Амплификация. Выделенную с помощью выше описанных методик ДНК переносили в реакционную смесь для проведения реакции амплификации. Реакционная смесь для ПЦР содержала биотинилированные праймеры, комплементарные области pol ВИЧ1. Амплификацию проводили по программе: 950°С — 5 минут, 5 циклов: 950°С — 15 секунд, 550°С — 15 секунд, 720°С — 15 секунд, 30 циклов: 950°С — 15 секунд, 580°С — 15 секунд, 720°С — 15 секунд.

Детекция продуктов амплификации. Детекцию осуществляли методом гибридизационно-ферментного анализа (ГИФА) на иммунологических планшетах, покрытых ДНК зондом, комплементарным внутренней части ампликона.

Анализ результатов

Пробу считали положительной, если оптическая плотность в лунках микропланшета превышала 0,35 ОЕ. Пробу считали отрицательной, если оптическая плотность в лунках микропланшета была меньше 0,35 ОЕ.

Для сравнения двух методик выделения ДНК на этапе ГИФА анализировали не только исходные образцы ампликонов, но и их разведения (для получения результатов оптической плотности в пределах линейного диапазона спектрофотометра от 0,35 до 2,0 ОЕ). Для этого перед началом проведения ГИФА из исходного ампликона делали серию последовательных 5-кратных разведений.

Результаты

Сравнение разных методик выделения ДНК показало, что в обоих случаях были получены положительные результаты, как в исходных продуктах амплификации, так и в их разведениях, причем количество разведений с положительным результатом было одинаковым (табл. 1.). Как видно из таблицы 1 значения оптических плотностей в максимальных разведениях (1:625) не отличались друг от друга.

Таблица 1. Результаты ГИФА детекции продуктов амплификации, взятых в разведениях.

1 — результаты, полученные при использовании методики выделения ДНК с использованием раствора «Гемолитик».

2 — результаты, полученные при использовании полуавтоматической методики выделения ДНК.

В процессе апробации разработанной методики на клиническом материале в сравнении с методикой, используемой в тест-системе «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» было параллельно протестировано 205 образцов цельной крови от ВИЧ-инфицированных пациентов. Получили полное совпадение результатов: во всех исследуемых образцах была выявлена ДНК ВИЧ независимо от использованной методики выделения.

Заключение

Эффективность выделения ДНК с помощью разработанной полуавтоматической методики была идентична эффективности методики, используемой в тест-системе «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96». Использование прибора «KingFisher» позволяет автоматизировать и значительно ускорить процедуру выделения ДНК, а также уменьшить количество лабораторных ошибок на этапе пробоподготовки.

Публикации

Новости

© 2007-2017, Федеральный научно-методический Центр по профилактике и борьбе со СПИДом
Работает на 4Site CMS
Сделано в Метод Лаб