Федеральный научно-методический Центр по профилактике и борьбе со СПИДом
Перейти на главную страницу сайта
Последние эпидемиологические данные по ВИЧ-инфекции в Российской Федерации
(по состоянию на 31.12.2014 г.)
Кумулятивное количество зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции среди граждан Российской Федерации (с 1987 г. по 31.12.2014 г.):907607
Количество людей, живущих с диагнозом ВИЧ/СПИД в Российской Федерации на 100 000 населения (пораженность):494,6
Количество новых случаев ВИЧ-инфекции среди граждан Российской Федерации в 2014 г. :85252
Основные причины заражения ВИЧ среди впервые выявленных в 2014 г. ВИЧ-позитивных с установленными факторами риска заражения:
— употребление наркотиков нестерильным инструментарием:57,3%
— гетеросексуальные контакты:40,3%
© Федеральный научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом
Подробная статистика
Тел. +7 (495) 366-05-18, 365-30-09

ИНФОРМАЦИЯ

Уважаемые посетители!
На официальном сайте Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом запрещается распространение и пропаганда диссидентской теории ВИЧ и альтернативных методов лечения ВИЧ-инфекции.



Посетители, распространяющие подобную информацию, будут заблокированы.

Сравнение двух тест-систем для количественного определения РНК ВИЧ в плазме крови "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" и "LCx HIV RNA Quantitative assay" в процессе клинических испытаний

С использованием образцов крови от Российских пациентов, инфицированных ВИЧ

Богословская Е. В., Цыганова  Г. М., Башкирова Л. Ю., Шипулин Г. А., Орехов В. // Сравнение двух тест-систем для количественного определения РНК ВИЧ в плазме крови «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» и «LCx HIV RNA Quantitative assay» в процессе клинических испытаний с использованием образцов крови от Российских пациентов, инфицированных ВИЧ. // Сборник тезисов 5-й Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных болезней. — Москва, 2004, С. 180-188.

Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва; 2 Эбботт лабориториз С. А., Москва


В соответствии с современными требованиями определение концентрации РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в плазме крови («вирусной нагрузки») является обязательной процедурой, начиная с момента постановки диагноза ВИЧ-инфекции, а также на этапе назначения противовирусной терапии и дальнейшего мониторинга эффективности терапии. Проведение такого рода исследований стало возможным после разработки и внедрения целого ряда количественных тест-систем для определения концентрации РНК ВИЧ. На сегодняшний день существует несколько подходов для количественного определения РНК ВИЧ: полимеразная цепная реакция (ПЦР) с обратной транскрипцией; изотермальная амплификация (NASBA) и bDNA (разветвленная ДНК-гибридизация). В России используется только подход на основе ПЦР, и до последнего времени для количественного определения РНК ВИЧ применялась единственная тест-система производства «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария) "Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5".

Недавно разработанная фирмой «Эбботт» (Швейцария) тест-система "LCx HIV RNA Quantitative assay" (на основе ПЦР) была проанализирована в ряде сравнительных испытаний [1-4]. Была показана ее высокая эффективность по выявлению большинства субтипов ВИЧ-1. Однако в России, где циркулируют разнообразные субтипы ВИЧ, подобных работ не проводилось. До 1996 года в России среди пациентов отмечались носители 8 субтипов ВИЧ-1: A, B, C, D, G и H и несколько рекомбинантных форм (табл. 1), причем доминировал субтип В. Ситуация резко изменилась в 1996 г., когда вирус попал в среду наркоманов, практикующих внутривенное введение психоактивных препаратов. Число случаев ВИЧ-инфекции начало возрастать в геометрической прогрессии, а распределение субтипов кардинально изменилось. В 2001 году субтип А составил 93% от всех субтипов [5].

Субтипы ВИЧ-1 До 1996 г. 2001 г.
A 11 93
B 42 2
C 7 <1
D 3 <1
F   <1
G 36 <1
H <1 <1
CRF04 AB   4
CRF01 АЕ <1 <1
CRF02 АG <1  

Целью настоящей работы являлось проведение расширенных клинических испытаний тест-системы "LCx HIV RNA Quantitative assay" для определения ее диагностической ценности по сравнению с тест-системой "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" при тестировании Российских ВИЧ-инфицированных пациентов.

Материалы и методы

Пациенты. В работе были исследованы образцы цельной крови, полученные в 2003 году от 207 ВИЧ-инфицированных пациентов из 12 регионов РФ: Москва и Московская область, Брянская область, Самарская область, Нижегородская область, Алтайский край, Иркутская область, Краснодарский край, Хабаровский край, Красноярский край, Волгоградская область, Тульская область и Якутия. Панель генетически разнообразных штаммов ВИЧ. Панель из 50 образцов плазмы крови, содержащих ВИЧ разных субтипов и рекомбинантных форм, была предоставлена фирмой «Эбботт». Состав панели представлен в таблице 2.

Таблица 2. Панель субтипов ВИЧ-1

Субтипы Количество
A 6
B 5
C 8
D 6
F 6
G 3
CRF01_AE 5
CRF01_AG 7
Mosaic (URF) 4

Забор крови и подготовка ее к анализу. Кровь забирали утром натощак в пробирку с 3%-ным ЭДТА из расчета 1:20. В течение 6 часов с момента забора крови отбирали плазму. Для этого цельную кровь центрифугировали при 800-1600 g в течение 20 минут. Хранили образцы плазмы при температуре минус 700С.

Определение концентрации РНК ВИЧ. Концентрацию РНК ВИЧ определяли согласно прилагаемым к тест-системам инструкциям. Заявленные характеристики тест-систем и процедура анализов были следующими:

1. Тест-система "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5". Линейный диапазон измерения концентрации РНК ВИЧ от 400 до 750.000 копий РНК/мл. РНК выделяли из 200 мкл плазмы крови путем высаживания изопропанолом. Затем РНК элюировали в 400 мкл и 50 мкл добавляли в амплификационную смесь. Амплификацию и детекцию продуктов ПЦР осуществляли автоматически, используя анализатор Cobas Amplicor («Хоффманн-Ла Рош», Швейцария).

2. Тест-система "LCx HIV RNA Quantitative assay". Линейный диапазон измерения концентрации РНК ВИЧ от 178 до 5.000.000 копий РНК/мл. РНК выделяли из 100 мкл плазмы крови путем хроматографического разделения нуклеиновых кислот с помощью колонок производства QIAGEN (Германия). Очищенную РНК элюировали в 120 мкл и 50 мкл добавляли в амплификационную смесь. Амплификацию проводили на амплификаторе LCx Thermal Cycler («Эбботт», США). Детекцию продуктов ПЦР осуществляли автоматически, используя анализатор LCx («Эбботт», США).

Степень совпадения количественных результатов. Для оценки сопоставимости количественных результатов было протестировано 207 образцов плазмы крови от ВИЧ-позитивных пациентов и 50 образцов с охарактеризованным субтипом ВИЧ-1. Результаты, полученные с помощью двух тест-систем "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" и "LCx HIV RNA Quantitative assay", считали совпадающими, если разница между ними не превышала 0,5 lg. Корреляцию результатов, полученных с помощью двух тест-систем, оценивали, рассчитывая коэффициент корреляции по Спирмену.

Определение субтипа ВИЧ в образцах крови Российских пациентов. Определение субтипа ВИЧ осуществляли, используя РНК вируса, выделенную из плазмы крови. Те образцы, в которых концентрация РНК была ниже 1000 копий/мл, типировали, используя провирусную ДНК, выделенную из лейкоцитов крови. ДНК или кДНК амплифицировали в формате Nested-PCR, используя четыре группы праймеров. Одна группа праймеров была выбрана для амплификации гена протеазы (размером 297 п. н.), другая — для фрагмента гена обратной транскриптазы (размером 600 п. н.), третья — для фрагмента гена gag (размером 450 п. н.), четвертая — для фрагмента гена поверхностного белка (размером 1100 п. н.). Расшифровку нуклеотидной последовательности продуктов амплификации осуществляли методом секвенирования с помощью автоматического секвенатора ABI Prism 3100 фирмы "Applied Biosystems" (США). Расшифрованную нуклеотидную последовательность анализировали с помощью специализированной программы, представленной на сайте Национального Центра Биотехнологической информации (NCBI) http://www.ncbi.nih.gov/projects/genotyping.

Результаты

Корреляция результатов. Выявлена высокая степень корреляции результатов измерения концентрации РНК ВИЧ, полученных с помощью тест-систем "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" и "LCx HIV RNA Quantitative assay": коэффициент корреляции составил 0,93; pv Корреляция результатов. Выявлена высокая степень корреляции результатов измерения концентрации РНК ВИЧ, полученных с помощью тест-систем "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" и "LCx HIV RNA Quantitative assay": коэффициент корреляции составил 0,93; pv < 0,001 (рис. 1). В среднем разница между значениями, полученными с помощью двух тест-систем, составила 0,27 lg. Дискордантные результаты (когда разница между значениями превышала 0,5 lg наблюдались в 13% случаев. Разница между результатами не превышала 1,1 lg. В таблице 3 показано распределение дискордантных результатов.

Таблица 3. Распределение образцов в зависимости от разницы между результатами измерения вирусной нагрузки, полученными с помощью тест-систем "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" и "LCx HIV RNA Quantitative assay".

Разница логарифмов концентрации РНК ВИЧ (LCx – Cobas Amplicor) Количество образцов/%
от 0,51 до 1 lg 3/1,3
В пределах 0,5 lg 209/87,1
от -0,51 до -1,1 lg 28/11,7

Рисунок 1. Корреляция результатов измерения вирусной нагрузки с помощью тест-систем "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" и "LCx HIV RNA Quantitative assay"

Высокая степень совпадения результатов была выявлена при тестировании образцов плазмы крови от Российских ВИЧ-инфицированных пациентов. Частота дискордантных результатов составляла 10,6%.

При тестировании образцов с охарактеризованным субтипом из панели, предоставленной фирмой «Эбботт», было выявлено большее количество дискордантных результатов (24%) по сравнению с панелью Российских образцов. Как видно из таблицы 4, дискордантные результаты наблюдались, в основном, в образцах, содержащих ВИЧ субтипов G (67%), A (50%) и C (50%).

Таблица 4. Отличия между результатами вирусной нагрузки, полученными с помощью двух тест-систем на панели образцов, содержащих ВИЧ разных субтипов

Субтипы ВИЧ, представленные в панели Разница логарифмов концентрации РНК ВИЧ
D 0,18
D 0,11
D 0,34
D 0,31
D 0,34
D 0,14
G 0,16
G 0,66
G 0,82
F 0,32
F 0,30
F 0,08
F 0,00
F 0,51
F2 0,28
A 0,52
A 0,16
A 0,75
A 0,54
A 0,33
A 0,22
CRF01_AE 0,22
CRF01_AE 0,25
CRF01_AE 0,39
CRF01_AE 0,65
CRF01_AE 0,11
CRF02_AG 0,19
CRF02_AG 0,25
CRF02_AG 0,45
C 0,35
C 0,64
C 0,05
C 0,83
C > 0,63
C 0,53
C 0,42
C 0,09
B 0,06
B 0,20
B 0,04
B 0,08
B 0,01
Mosaic 0,46
Mosaic 0,63
Mosaic 0,28
Mosaic 0,38

В процессе испытаний было выявлено 17 образцов плазмы крови (8,2%) вне линейного диапазона тест-системы "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5": 12 образцов — ниже линейного диапазона (т. е., с концентрацией менее 400 копий/мл) и 5 образцов — выше линейного диапазона (т. е., с концентрацией выше 750.000 копий/мл). При анализе образцов с помощью тест-системы "LCx HIV RNA Quantitative assay" было выявлено только 8 образцов ниже уровня линейного измерения тест-системы (т. е., с концентрацией менее 178 копий/мл).

Типирование образцов от Российских пациентов показало, что наиболее распространенным субтипом ВИЧ в России является субтип А (93%) и в небольшом количестве присутствуют субтипы В (5%), G (1,5%) и С (0,5%). Все дискордантные результаты были получены на образцах, содержащих ВИЧ субтипа А. Причем, в 95,5% случаев результат, полученный с помощью тест-системы "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5", был выше результата, полученного с помощью тест-системы "LCx HIV RNA Quantitative assay".

Обсуждение

Тест-система «LCx HIV RNA Quantitative assay», предназначенная для количественного определения РНК ВИЧ, была не однократно исследована в клинических испытаниях по сравнению с тест-системами "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5", "Quantiplex HIV-1 RNA v. 3.0" и "NucliSens HIV QT 2.0". В большинстве исследований была выявлена высокая степень корреляции результатов [1-4]. Максимальная сопоставимость результатов наблюдалась при исследовании образцов, содержащих субтип В.

Поскольку в России доминирует ВИЧ субтипа А, а также распространены и другие субтипы ВИЧ-1, представляет интерес изучение эффективности выявления РНК ВИЧ с помощью тест-системы «LCx HIV RNA Quantitative assay» в образцах от Российских пациентов.

В настоящей работе было проведено исследование 207 образцов плазмы крови от ВИЧ-инфицированных пациентов, проживающих в разных регионах России, а также панель образцов с ранее охарактеризованными субтипами ВИЧ-1, которые были получены от ВИЧ-инфицированных пациентов из разных стран мира.

При тестировании образцов с помощью тест-систем "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" и "LCx HIV RNA Quantitative assay" была показана высокая корреляция результатов, что согласуется с ранее полученными данными [1-4]. Анализ результатов, полученных на панели образцов, содержащих разные субтипы ВИЧ, показал, что дискордантные результаты наблюдались с высокой частотой на образцах, содержащих субтипы А (50%), С (50%) и G (67%). Все дискордантные результаты, полученные на Российских образцах, соответствовали ВИЧ субтипа А (10,6%). Несоответствие частоты дискордантных результатов, полученных на панели субтипов ВИЧ и на образцах от Российских пациентов, объясняется, с одной стороны, разным распределением субтипов в этих группах (у Российских пациентов доминировал ВИЧ субтипа А — 93%), а с другой стороны, специальным подбором образцов в панель субтипов. Полученные в нашей работе результаты совпадают с данными зарубежных авторов, согласно которым наибольшее количество дискордантных результатов наблюдалось на образцах, содержащих ВИЧ субтипа А [1, 2].

Показатели вирусной нагрузки, полученные в процессе исследования Российских пациентов, в большинстве случаев укладывались в линейный диапазон изучаемых тест-систем. Причем, у тест-системы "LCx HIV RNA Quantitative assay" линейный диапазон измерения концентрации РНК значительно шире, чем у тест-системы "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5". Поэтому число образцов с концентрацией РНК ВИЧ вне линейного диапазона тест-системы "LCx HIV RNA Quantitative assay" было в 2 раза ниже, чем для тест-системы "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5»".

Тест-система "LCx HIV RNA Quantitative assay" оказалась достаточно простой в использовании: стадии выделения РНК и детекции продуктов ПЦР автоматизированы. Детекция продуктов амплификации осуществляется с помощью автоматического анализатора LCx фирмы «Эбботт», который не требует сложного программирования по сравнению с аналогичным анализатором Cobas Amplicor фирмы «Хоффманн-Ла Рош». Для проведения количественного анализа 24 образцов с помощью тест-системы "LCx HIV RNA Quantitative assay" требуется приблизительно 7 часов в отличие от 9 часов при использовании тест-системы "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5". К недостаткам тест-системы "LCx HIV RNA Quantitative assay" можно отнести разделение набора на 2 независимых комплекта реагентов. Один комплект предназначен для выделения РНК из клинического материала и позволяет обработать 250 образцов. Другой комплект предназначен для амплификации и детекции продуктов ПЦР и позволяет проанализировать только 96 образцов.

Выводы

  1. Выявлена высокая степень корреляции результатов, полученных с помощью двух тест-систем "LCx HIV RNA quantitative assay" и "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5 Assay".
  2. В 87% случаев отличия между результатами находились в пределах 0,5 lg.
  3. Тест-система "LCx HIV RNA Quantitative assay" обладает большим диапазоном измерения концентрации РНК ВИЧ, чем тест-система "Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5".
  4. На основании полученных результатов тест-систему "LCx HIV RNA quantitative assay" можно рекомендовать к регистрации и использованию на территории РФ.

Литература

  1. P. Swanson, V. Soriano, S. G. Devare, J. Hackett. Comparative performance of three viral load assays on Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) isolates representing group M (subtypes A to G) and group O: LCx HIV RNA Quantitative, Amplicor HIV-1 Monitor Version 1.5, and Quantiplex HIV-1 RNA Version 3.0. J. Clin. Microbiol. 2001. Vol. 39, №3, p. 862-870.
  2. Troonen H., Grey  H., Michel G. Multicenter study of the LCx HIV RNA quantitative assay — a new competitive reverse transcriptase-PCR which targets pol genomic region of HIV-1 for the measurement of type B, non-type B and group O HIV-1 RNA. Clin. Chem. Lab. Med. 2002. 40(7): 698-704.
  3. Plantier J. C., Gueudin  M., Damond F. et al. Plasma RNA quantification and HIV-1 divergent strains. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2003, 1; 33(1): 1-7.
  4. C. de Mendoza, J. Alcami, M. Sainz et al. Evaluation of the Abbott LCx Quantitative assay for measurement of Human Immunodeficiency Virus RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 2002. Vol. 40, №4, p. 1518-1821.
  5. А. Ф. Бобков, Е. В. Казеннова, М. Р. Бобкова и др. // Молекулярно-генетическая характеристика ВИЧ-1 на территории России. // Вестник Российской Академии медицинских наук. 2002, №8.

Публикации

Новости

© 2007-2017, Федеральный научно-методический Центр по профилактике и борьбе со СПИДом
Работает на 4Site CMS
Сделано в Метод Лаб