Разработка модифицированной версии тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М» Богословская Е. В., Башкирова Л. Ю., Шипулин Г. А. // Разработка модифицированной версии тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М». // Сборник тезисов 5-й Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных болезней. — Москва, 2004. С. 173-180. Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва
Введение На сегодняшний день из 42 миллионов человек, живущих с ВИЧ-инфекцией, 3,2 миллиона составляют дети. По оценкам Программы ООН по ВИЧ/СПИД (UNAIDS) в 2003 году 700.000 детей были инфицированы вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), из них 90% — дети, рожденные инфицированными матерями, и получившими вирус внутриутробно, в родах или при грудном вскармливании. В России по состоянию на 10 февраля 2004 года зарегистрировано 266820 случаев ВИЧ-инфекции, из них 9154 среди детей. В 2002 году от ВИЧ-инфицированных матерей родилось 2770 детей — это 60% от всех рожденных в России детей с риском перинатальной передачи ВИЧ. Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, затруднена в связи с тем, что в крови таких детей в течение длительного времени сохраняются материнские антитела к ВИЧ. Но далеко не каждый ребенок, рожденный инфицированной женщиной, заражен ВИЧ. Риск вертикальной передачи ВИЧ-инфекции колеблется от 10 до 40%. Проведение профилактических мероприятий (противовирусная терапия, родоразрешение путем кесарева сечения, отказ от кормления грудью и другие мероприятия) позволяют снизить риск передачи ВИЧ до 2-5%. По существующим в России рекомендациям постановка или снятие диагноза ВИЧ-инфекции детям, рожденным от ВИЧ-инфицированных матерей, проводится на основании результатов серологического обследования не ранее 18 месяцев [1]. Проблема более ранней диагностики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей за рубежом была решена несколько лет назад с появлением молекулярно-генетические методов, которые позволяют выявлять фрагменты генома ВИЧ в периферической крови на ранних сроках инфицирования. Было показано, что у большинства инфицированных детей ДНК ВИЧ определяется к 1 месяцу жизни и практически у всех к 6 месяцу. В России до сих пор молекулярные методы диагностики ВИЧ у новорожденных детей не нашли широко применения. В основном это связано с высокой стоимостью зарубежных тест-систем и отсутствием до последнего времени аналогичного теста отечественного производства. В 1997 году в Центральном НИИ Эпидемиологии МЗ РФ была разработана тест-система (на основе полимеразной цепной реакции) для выявления ДНК ВИЧ «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96». Тест-система прошла Государственные испытания в ГИСК им. А. Л. Тарасевича, и в 2002 году было получено разрешение Министерства Здравоохранения на применение тест-системы на территории РФ (регистрационное удостоверение №PN001634/01-2002; лицензия на производство №15/0002-Л/02). Единственной зарубежной тест-системой, доступной в России, является "Amplicor HIV 1 test" фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария). Методики, положенные в основу отечественной и зарубежной тест-систем, аналогичны. В обеих тест-системах используются одинаковые праймеры, комплиментарные области генома ВИЧ — gag — гену, предложенные в 1988 году Shirley Kwok. Клинические испытания отечественной тест-системы были проведены на 175 образцах от 107 пациентов в сравнении с тест-системой "Amplicor HIV 1 test". Были определены основные характеристики тест-системы: чувствительность 96%, специфичность 100% [3]. В последние годы стали появляться данные о том, что тест-система "Amplicor HIV 1 test" обладает более низкой чувствительностью по сравнению с заявленной. Было показано, что используемые в тест-системе праймеры позволяют детектировать 87% изолятов подвида А, 67% изолятов подвида В, 66% изолятов подвида Е, 88% изолятов подвида F [2]. Поэтому чувствительность тест-системы зависит от распространенности разных подвидов ВИЧ на данной территории. На территории России распространено большинство из известных подвидов ВИЧ. Кроме того, если до 1996 года в России доминировал субтип В, то в 2002 году субтип А составил 93% от всех субтипов (по данным Бобкова А. Ф.). Другим важным недостатком тест-систем как "Amplicor HIV 1 test", так и «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» является нестандартизованный метод выделения ДНК из клеток крови и отсутствие внутреннего контроля, что создает зависимость от качества выполнения процедур в процессе выделения ДНК и увеличивает частоту артефактных ложноотрицательных результатов. В 2003 году сотрудниками ФНМЦ СПИД была проведена оценка клинической чувствительности и специфичности тест-системы "Amplicor HIV 1 test" по результатам работы региональных центров СПИД [4]. Показатель специфичности составил 99%, показатель чувствительности 51%. Низкая выявляемость ВИЧ могла быть обусловлена двумя причинами: недостаточной чувствительностью праймеров в отношении доминирующего в России субтипа А, а также плохим уровнем подготовки персонала, что в совокупности с отсутствием внутреннего контроля в тест-системе приводило к получению ложноотрицательных результатов. В связи с этим целью настоящей работы была разработка и апробация второй версии тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М». Материалы и методы. В работе были исследованы образцы цельной крови, полученные от следующих пациентов. Первая группа была представлена 465 образцами цельной крови от 230 детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей и наблюдающихся стационарно или амбулаторно в КИБ №2 г. Москвы за период 1998-2001 гг. Возраст детей колебался от 1 дня до 1,5 лет. Вторая группа состояла из 205 образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов, полученных из 12 регионов Российской Федерации в 2003 году. Все образцы были типированы методом секвенирования четырех фрагментов генома ВИЧ: гена протеазы, фрагмента гена обратной транскриптазы, фрагмента гена gag и фрагмента гена поверхностного белка. Из 205 образцов 93% составил субтип А, 5% — субтип В, 1,5% — субтип G, 0,5% — субтип С. Подготовка проб крови. Кровь забирали из локтевой вены утром натощак в пробирки с 1/10 объема 3% ЭДТА. Цельную кровь хранили при температуре +2-80°С не более 3 дней. Выделение ДНК из клеток крови. Выделение ДНК проводили с помощью двух методик. Первый вариант представляет собой грубый лизис эритроцитов крови с помощью раствора «Гемолитик» (производства ЦНИИЭ МЗ РФ), в результате чего получали осадок лейкоцитов. Второй вариант представляет собой селективную иммуно-сорбцию CD4-лимфоцитов с помощью магнитных частиц, покрытых антителами к CD4 рецепторам, и полуавтоматического экстрактора KingFisher («Thermo Labsystems», Финляндия). В результате получали осадок CD4-лимфоцитов. Затем осадки лейкоцитов или CD4-лимфоцитов лизировали с помощью раствора «Цитолизин» (производства ЦНИИЭ МЗ РФ) при температуре 60°С в течение 30 минут. Амплификация. Для эффективного выявления большинства субтипов ВИЧ-1 нами были выбраны праймеры в наиболее консервативной области генома ВИЧ — гене полимеразы. При подборе праймеров использовали базы данных нуклеотидных последовательностей и программы BLAST и OLIGO 3.30. Праймеры синтезировали с помощью автоматического синтезатора ASM102. На 5`-конце один из праймеров мечен биотином, который необходим для гибридизационно-ферментной детекции продуктов амплификации. Для оценки эффективности выделения ДНК, а также возможного ингибирования ПЦР были разработаны праймеры для амплификации участка клеточной ДНК — гена b-глобина. Один из праймеров для амплификации гена b-глобина на 5`-конце был помечен биотином. Реакционная смесь для ПЦР содержала две пары праймеров: для выявления ВИЧ и гена b-глобина. Амплификацию проводили по программе: 950С — 5 минут, 5 циклов: 950С — 15 секунд, 550С — 15 секунд, 720С — 15 секунд, 30 циклов: 950С — 15 секунд, 580С — 15 секунд, 720С — 15 секунд. Гибридизационно-ферментная детекция продуктов ПЦР. Детекцию осуществляли методом гибридизационно-ферментного анализа на иммунологических планшетах, покрытых одноцепочечным ДНК зондом, комплиментарным внутренней части ампликона. Для детекции продуктов ПЦР использовали два микропланшета: один — покрытый зондом к ВИЧ, второй — покрытый зондом к гену глобина. Пробу считали положительной, если оптическая плотность в лунках микропланшета, покрытых зондом к ВИЧ, превышала 0,35 ОЕ. Пробу считали отрицательной, если оптическая плотность в лунках микропланшета, покрытых зондом к ВИЧ, была меньше 0,35 ОЕ, а оптическая плотность в лунках микропланшета, покрытых зондом к гену глобина, превышала 0,35 ОЕ. Выявление ДНК ВИЧ с помощью тест-системы "Amplicor HIV 1 test". 205 образцов цельной крови от детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, было протестировано параллельно с помощью двух тест-систем "Amplicor HIV 1 test" и «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М». Определение ДНК ВИЧ с помощью тест-системы "Amplicor HIV 1 test" осуществляли согласно прилагаемой инструкции. Тестирование коммерческой панели субтипов. Для того, чтобы доказать, что выбранные нами праймеры в области гена полимеразы эффективно выявляют большинство субтипов ВИЧ-1, была протестирована панель образцов плазмы крови (содержащая 10 субтипов ВИЧ-1), предоставленная Национальным институтом биологических стандартов и контролей Великобритании (NIBSC) (кат. №01/466). Образцы плазмы тестировали с помощью количественной тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» (ЦНИИЭ МЗ РФ), в которой используются те же самые праймеры, комплиментарные гену полимеразы. Для сравнения результатов были использованы коммерческие тест-системы "Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария) и "LCx HIV RNA Quantitative assay" фирмы «Эбботт» (США). В тест-системе "Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" используются праймеры, отличные от тех, которые используются в качественной тест-системе "Amplicor HIV-1 test". Результаты Коммерческая панель образцов NIBSC, содержащих вирусные препараты 10 субтипов ВИЧ-1, была проанализирована с помощью трех количественных тест-систем "Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" («Хоффманн-Ла Рош», Швейцария), "LCx HIV RNA Quantitative assay" («Эбботт», США) и «АмплиСенс ВИЧ Монитор» (ЦНИИЭ МЗ РФ). Результаты измерения концентрации РНК ВИЧ представлены в таблице 1. | № | Субтипы ВИЧ-1 | Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5 | LCx HIV RNA Quantitative assay | АмплиСенс ВИЧ Монитор | | 1 | C | 3,68x103 | 3,54х103 | 1,62х104 | | 2 | H | 1,25x104 | 5,40х103 | 1,58х104 | | 3 | A | 4,31x103 | 3,80х103 | 1,17х104 | | 4 | N | 2,63x103 | 596 | < 500 | | 5 | B | 2,26x103 | 2,51х103 | 4,18х103 | | 6 | E | 5,05x103 | 3,89х103 | 1,12х104 | | 7 | O | – | – | – | | 8 | D | 2,81x103 | 6,68х103 | 1,47х104 | | 9 | G | 4,82x103 | 3,36х103 | 2,46х103 | | 10 | F | 5,08x103 | 5,12х103 | 5,96х103 | Как видно из таблицы большинство субтипов ВИЧ-1 тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор» выявляет с такой же эффективностью, что и зарубежные коммерческие тест-системы. Отечественная тест-система не выявляет ВИЧ группы О и плохо выявляет ВИЧ группы N. Для сравнения двух вариантов выделения ДНК из цельной крови было протестировано 205 образцов цельной крови от ВИЧ-инфицированных пациентов с помощью тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М» в трех повторах: 2 повтора в варианте лизиса эритроцитов с помощью гемолитика и 1 повтор в варианте иммуно-сорбции. Всего было выполнено 615 ПЦР-анализов. Для 205 образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов был получен положительный результат на ВИЧ (во всех трех повторах, независимо от прохождения внутреннего контроля). В 24 случаях наблюдалось отсутствие оптического сигнала в лунках микропланшета, покрытых зондом к гену глобина. Причинами могли быть потеря осадка лейкоцитов в процессе выделения ДНК или наличие ингибиторов ПЦР в выделенной пробе. В 15 случаях кровь обрабатывали раствором гемолитика, в 9 — кровь обрабатывали в варианте иммуно-сорбции. При перестановке этих образцов ингибирующего эффекта не наблюдалось. При исследовании 465 образцов цельной крови от 230 детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, было выявлено 26 детей, инфицированных ВИЧ (11,3%). При параллельном тестировании 205 образцов с помощью тест-системы «Amplicor HIV 1 test» было получено полное совпадение результатов. Обсуждение Ранняя диагностика ВИЧ-инфекция у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, может быть осуществима только с помощью молекулярно-генетических методов, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Использующиеся до настоящего времени в России тест-системы («АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» и "Amplicor HIV-1 test") обладают рядом существенных недостатков, которые ограничивают использование этих тестов в нашей стране. Главным недостатком тест-систем являются используемые праймеры, выбранные в 1988 году и предназначенные в основном для выявления ВИЧ субтипа В. В России в настоящее время доминирует субтип А, который выявляется с помощью данных праймеров с чувствительностью 87%. Другим важным недостатком является отсутствие внутреннего контроля, что может приводить к появлению большого количества ложноотрицательных результатов. В результате нами была предпринята попытка разработать новую тест-систему для выявления ДНК ВИЧ, которая будет лишена всех выше перечисленных недостатков. Новая версия тест-системы, получившая название «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», имеет следующие отличительные особенности. В тест-системе используются праймеры, выбранные нами в области гена полимеразы (наиболее консервативная область генома ВИЧ), которые позволяют эффективно выявлять большинство субтипов ВИЧ-1. Для экспериментального подтверждения были использованы количественные тест-системы для определения концентрации РНК ВИЧ и коммерческая панель образцов плазмы крови, содержащая 10 субтипов ВИЧ-1 (NIBSC, кат. №01/466). Причин для такого эксперимента было несколько. Во-первых, в мире не существует коммерческих панелей, содержащих провирусную ДНК ВИЧ разных субтипов. Во-вторых, количественные анализы позволяют с большей точностью говорить о том, на сколько эффективно выявляется тот или иной субтип. Для сравнения количественных результатов были использованы 2 коммерческие тест-системы "Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5" фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария) и "LCx HIV RNA Quantitative assay" фирмы «Эбботт» (США), которые должны с одинаковой эффективностью выявлять большинство субтипов ВИЧ-1, включенных в изучаемую панель. Все субтипы ВИЧ, относящиеся к группе М, с одинаковой эффективностью были выявлены с помощью трех используемых тест-систем. Ни одна из тест-систем не выявила образец, содержащий ВИЧ группы О. Отечественная тест-система с низкой эффективностью выявляла образец, содержащий ВИЧ группы N. Однако, актуальность выявления вируса из групп N и О не высока в силу низкой распространенности этих групп ВИЧ в популяции (в России не было до сих пор выявлено ни одного пациента, инфицированного ВИЧ групп N и О). Второй важной особенностью новой версии тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» является использование внутреннего контроля. В качестве внутреннего контроля была использована человеческая геномная ДНК (выбранные праймеры комплиментарны области гена b-глобина), которая экстрагируется из лейкоцитов крови вместе с ДНК ВИЧ, встроенной в человеческую ДНК. В наших экспериментах наблюдалось ингибирование внутреннего контроля в 3% случаев. В лабораториях, где работают менее опытные врачи-лаборанты, частота ингибирования внутреннего контроля может быть значительно выше. Третьей особенностью тест-системы является возможность использования полуавтоматического метода выделения CD4-лимфоцитов из цельной крови. Данный подход позволил упростить и стандартизовать методику выделения клеток крови, инфицированных ВИЧ. Исследование образцов из группы ВИЧ-инфицированных пациентов показало, что с помощью тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 100% случаев была выявлена ДНК ВИЧ. Стопроцентная выявляемость ДНК ВИЧ, несмотря на ингибирование ВКО в 3% случаев, свидетельствует о высокой концентрации ДНК ВИЧ в этих образцах. Однако не исключена возможность появления таких образцов крови, в которых концентрация ВИЧ будет низкая. Тогда даже небольшое ингибирование ПЦР приведет к появлению ложноотрицательного результата. В нашем исследовании из 205 образцов крови была выявлена одна с низким содержанием ДНК ВИЧ (оптический сигнал для данного образца колебался в диапазоне 0,8-2,8 OD при отсутствии признаков ингибирования). Для определения диагностической ценности тест-системы была протестирована группа детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Из 230 детей 26 оказались инфицированными ВИЧ. Из 205 образцов крови от новорожденных детей, исследованных параллельно с помощью тест-систем «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» и "Amplicor HIV-1 test", не было выявлено ни одного дискордантного результата. Одинаковая выявляемость ДНК ВИЧ может объясняться с одной стороны высокой концентрацией вируса в исследуемых образцах, с другой стороны тем, что в 1998-2001 годах в Москве у беременных женщин доминировал ВИЧ субтипа В, который с высокой эффективностью выявляется обеими тест-системами. Заключение Модифицированная тест-система «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М» обладает рядом преимуществ по сравнению с аналогичными тест-системами первого поколения: используемые праймеры, комплиментарные наиболее консервативной области генома ВИЧ — гену полимеразы, позволяют выявлять большинство субтипов ВИЧ-1 стандартизованный метод выделения ДНК и наличие внутреннего контроля позволяет полностью исключить риск появления ложноотрицательных результатов, приближая эффективность ДНК-диагностики ВИЧ-инфекции к 100%. Расширенные клинические испытания доказали возможность использования тест-системы как для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции у ВИЧ-инфицированных взрослых пациентов, так и для ранней постановки диагноза ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Литература - Инструкция по профилактике передачи ВИЧ-инфекции от матери ребенку и образца информированного согласия на проведение химиопрофилактики ВИЧ (Утверждено приказом МЗ РФ 19.12.2003, №606).
- Respess R. A., Butcher A., Wang H. et al. // J. Clin. Microbiol. — 1997. — Vol. 35. — p. 1284-1286.
- Изучение чувствительности и специфичности отечественной ПЦР-тест-системы для диагностики ВИЧ-инфекции. // К. А. Саркисян, Г. А. Шипулин, М. С. Воробьева, О. Ю. Шипулина, В. И. Шахгильдян, Л. В. Серебровская, В. В. Покровский.
- Применение тест-системы Amplicor HIV-1 для диагностики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей в России: первые результаты (2001-2002 гг.) // Бобкова М. Р., Буравцова Е. В., Суханова А. Л. и др. // Клиническая Лабораторная Диагностика. — 2003. — №6. — с. 49-53.
| Публикации Новости |
